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    高通量篩選大腸桿菌重組蛋白生產用酵母營養素

    點擊次數:82 發布時間:2022-06-13

    隨著重組DNA技術的迅猛發展,外源基因在不同宿主中的表達使得各種重組蛋白的工業生物生產成為可能。選擇合適的宿主是生物工藝設計中的關鍵步驟之一,具體取決于:


    1.上游培養效率


    2.易于基因編輯和分子工具的可用性


    3.翻譯后修飾的能力,如糖基化


    4.蛋白質(用于下游加工和作為生物制藥成分等)的分泌能力


    目前,多種生物已被應用于重組蛋白的生產,尤其是大腸桿菌,易于基因改造,具有在酵母水解物等多種基質上快速生長并產生高蛋白滴度的優勢。已成為迄今為止業界追捧的主力軍。


    典型的生物工藝優化通常需要進行一些初步試驗,以發現適用于宿主菌株并提高目的重組蛋白表達的培養基成分(特別是氮基營養素)。對于此類應用需求,能夠提高實驗效率和參數準確度的高通量篩選平臺成為熱門工具。貝克曼庫爾特BioLector通過在線測量關鍵培養參數提供可放大的高通量分析。


    本案例為通過BioLector對多種酵母營養素就生物量生長和重組蛋白的形成進行評估和比較,篩選出了適合大腸桿菌重組蛋白生產和誘導時間的理想培養基。


    方法


    培養菌株:大腸桿菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。


    培養基:以標準TB培養基(Carl Roth)為參照物,對多個TB 樣(Terrific 液)培養基進行比較。不同的TB 樣培養基使用不同的酵母提取物。


    BioLector培養條件:在接種至微孔板之前,先在250 mL搖瓶中進行預培養, 37°C培養6小時。然后使用48孔梅花板(MTP-BOH2)在 BioLector中進行培養。溫度 37°C ,振搖速度:1400 rpm。分別在每個培養孔中填充800μL培養液用于非誘導實驗,填充790μL用于誘導實驗。誘導實驗中,在誘導時間點上添加 10μL 50μM 的 IPTG。環境氧氣濃度保持在35%,避免培養物缺氧。


    BioLector在線測量:培養過程中對生物量、EcFbFP(黃素熒光蛋白)、pH以及 DO進行在線測量。


    結果


    不同TB樣培養基的生物量生長情況:


    3.1.png


    培養實驗中,不同酵母營養素的培養基中生物量的生長情況如上圖所示:培養基不同,最終的光密度和生長速率也會不同。ProCel 6 中的大腸桿菌OD最高,培養基 ProCel 3 中的大腸桿菌的OD低。ProCel 6為本特定工藝的最高生長速率。


    3.2.png


    上圖為培養過程的DO值。培養基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培養物未達到0%的氧飽和度,這表明由于耗氧量有限,該培養基中的菌株代謝活性較低。相反,其他培養物包括TB標準培養基,均在短時間內達到0%的氧飽和度,表明菌株代謝活性高。


    不同酵母營養素TB樣培養基的產物生成:


    通過將IPTG 添加到培養物中來誘導 T7 聚合酶的表達促進黃素熒光蛋白的生成。BioLector使用梅花板為48個培養物提供了獨立的培養空間,因此可測試不同的誘導時間點。使用自動化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系統還可以自動進行培養誘導。


    首先選擇一個固定的誘導時間點。分別為培養啟動后的3小時、3.75小時和4.5小時。下圖所示為每種TB樣培養基在誘導時間下所測熒光的平均值。熒光動力學清晰地表明不同培養基有不同的EcFbFP(黃素熒光蛋白)表達水平。


    表現出最強熒光信號的兩個樣本為:ProCel 2,誘導點為3.75小時;ProCel 5,誘導點為 3 小時。經過 7.7 小時的培養,ProCel 5 的熒光值達到102.94a.u.,而ProCel 2 的熒光值達到 101.82 a.u.。本方法的不足之處在于未比較不同樣本的生物量對蛋白質產量的影響。經過3小時的培養,一些培養物的OD已達到6,而其他培養物僅達到3。當誘導具有不同光密度的培養物時,可能會對在每種酵母營養素上生長的實驗大腸桿菌的蛋白質生產性能造成誤解。


    3.3.png


    鑒于此,我們采用了一種新方法,將誘導點與生物量信號耦合。使用BioLector的信號驅動RoboLector,依賴于特定生物量的誘導對于每個單獨的孔都是可行的。為自動化工作站設置3、6或8的OD目標值,以根據孔內培養物的生長動力學自動添加IPTG以誘導蛋白質生產。


    如下圖所示,ProCel 2表現最佳,最終值為 146.23 a.u.,培養時間是 12.3 小時;ProCel 5表現次之,最終值為138.1 a.u.。與之前進行的一系列實驗相比,本實驗中的排名與在特定時間點進行誘導的實驗不同。這一觀察證明了最佳工藝條件的重要性,并使這些條件具有可比性。此處數據表明:與之前的實驗相比,本實驗中的熒光值更高。正如該領域諸多論文中所強調的那樣,誘導時間確實是一個關鍵參數。同樣,在優化大腸桿菌重組蛋白生產的過程中,也必須評估誘導劑的濃度。另外,與對照TB培養基相比,這里測試的一些酵母氮源產生了更高的重組蛋白產量。這些結果凸顯了選擇培養基成分的重要性,這些成分能夠在特定的生物工藝中實現高而穩定的產量。


    3.4.png


    結論


    通過BioLector系統,貝克曼庫爾特可為用戶提供適用于各種應用領域的高通量篩選平臺。其獨特的梅花形微孔板尤其適用于好氧培養,如同實驗室生物反應器,BioLector系統通過非侵入式傳感器使客戶能夠獲取更多的在線測量參數。正如本應用,通過BioLector系統可輕松實現培養基的篩選,整合自動化工作站的RoboLector,還可實現更多功能。補料、pH調控以及文中所述的誘導功能,所有這些均可在小規模實驗中實現,幫助客戶同時兼顧成本和效率。


    3.5.png


    RoboLector高通量自動化微型生物培養平臺


    欲了解該應用詳情,請掃描下方二維碼下載應用指南《利用BioLector進行大腸桿菌重組蛋白生產用酵母營養素的篩選》


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