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    貝克曼庫爾特 | 生物反應器可以進行細胞裂解、應激及毒性篩選的測定嗎

    點擊次數:86 發布時間:2022-06-09

     

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    微生物反應器的主要功能是模擬微生物生長或生產的自然環境,通過生化反應或微生物自身的代謝獲得目標產物。


    那么,它可以被用來進行細胞裂解、細胞應激及細胞毒性篩選的測定嗎?由于這類實驗通常樣品量比較大,或者需要離線檢測,又或者需要為此重新配置設備,同時人力和實驗成本也相當高等等。也許你會覺得不太可能。




    但是,貝克曼庫爾特的新技術BioLector XT高通量微型生物反應器卻可以做到。

     

     

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    BioLector XT高通量微型生物反應器

     

    它可以同時進行48個樣品的平行培養,每個培養體積為微升級別,并可以在線檢測各種信號,實現靈活補料和PH調控,且整個過程無需人員值守。因此無需改變任何配置,就既可以滿足微生物的高通量培養,又可以進行細胞裂解、應激及毒性篩選的測定。

    BioLector進行細胞裂解、應激及毒性篩選的測定:


    PI是一種多功能染料,常用于鑒別細胞群中的死細胞,并在多色熒光技術中用作復染劑。它僅能穿透細胞膜破裂的死細胞,嵌入細胞脫氧核糖核酸(DNA)后釋放紅色熒光,而不能穿透細胞膜完整的活細胞。

     

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    BioLector結合 PI 染色法進行細胞裂解、細胞應激及毒性篩選的具體應用。

     

    方法


     

    大腸桿菌培養:采用 BioLector進行大腸桿菌 Bl21(DE3)菌種培養,培養條件:溫度 37° C,振搖速度 800 rpm),微孔板為 BOH2 型 FlowerPlate® 微孔板(MTP),每孔填樣體積為800µL。培養基為緩沖液濃度為 50 mM 或 200 mM 的 Wilms-MOPS。


    PI 濃度:將 1mM PI 染色液溶于磷酸鹽緩沖液中配制 PI 原液。此原液需無菌過濾并在 4° C 下儲存。PI 嵌入 DNA 時,為避免對用戶造成傷害,培養基中的最終 PI 濃度不應過高。在本應用指南中,培養基最終 PI 濃度應為 5 µM。

     

    誘導細胞死亡:在此培養案例中,通過在 7 小時后將培溫度提升至 50°C或加入純甲醇(MeOH)來誘導細胞死亡。

     

    測定死亡細胞:誘導細胞死亡后,PI 滲入細胞膜破裂的細胞與 DNA 結合,導致熒光偏移,然后通過PI 濾光片模塊檢測死亡細胞的熒光信號。

     

    結果

     

    細胞毒性篩選:采用 BioLector 進行PI 染色和檢測進行細胞毒性篩選。添加 MeOH 對大腸桿菌 BL21(DE3)進行應激培養,如下圖所示。


     

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    不同濃度的MeOH作為應急因素對大腸桿菌培養的細胞毒性篩選

     

    培養 7 小時后,添加 27%v/v MeOH 時生長停滯,可通過散射光信號和 DO 信號檢測得出:添加 MeOH 后 DO 信號立即增至初始值(100 %),表明細胞開始凋亡。添加 9%v/v MeOH 導致散射光信號減弱,表明生長斜率下降與 DO 信號相呼應。18 小時后,添加 27%v/v 和 9%v/v MeOH 的細胞最終 PI 信號分別為 2.54 a.u. 和 1.57 a.u.。該結果對5µM PI培養基進行了空白扣除。

     

    細胞裂解的測定:如圖所示,培養 7 小時后,將溫度從 37° C 提升至 50°C 以誘導細胞裂解。散射光信號表明,經 5 µM PI 處理的大腸桿菌未進一步生長,熱處理 1 小時后對照組也未進一步生長。未經熱處理大腸桿菌(+ 5µM PI)的生長曲線顯示,細菌在 11 小時前呈指數增長,之后進入穩定期。熱處理后大腸桿菌停止生長,2 小時后,細胞開始裂解,因此 PI 信號呈線性增強,并約在培養 14 小時后達到飽和。之所以延遲 2 小時,是因為熱量在液體中分布并作用于細胞需要時間。未經熱處理組的 PI 曲線在指數生長期可觀察到背景熒光信號。


     

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    采用BioLector 通過 PI 染色測定細胞裂解


    應激細胞測定:在正在進行的培養實驗中,散射光和 PI 信號的結合有助于識別應激細胞。在以下案例中,大腸桿菌BL21 分別在兩種不同 MOPS 緩沖液濃度的 Wilms-MOPS 培養基中培養。下圖表示散射光、DO 信號、pH 值和 PI 信號隨培養時間變化的實驗結果。更多解析請見應用指南《利用BioLector進行細胞死亡的測定》。

     

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    采用 BioLector通過 PI 測量應激細胞

     

    從上述應用可以看到貝克曼庫爾特 BioLector高通量微生物反應器,不僅可以進行48個樣品的高通量發酵,同時在線參數檢測、補料和PH調控,從而實現高通量菌種篩選和工藝優化,而且結合 PI 染色法可以進行細胞裂解、細胞應激及毒性篩選的測定。

     

     

     

     

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