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        貝克曼庫爾特|NGS核酸純化之洗脫篇:用啥洗?加多少?洗多久?加熱嗎?

        點擊次數:255 發布時間:2022-05-09

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        貝克曼庫爾特基于SPRI技術的AMPure XPSPRIselect兩種NGS文庫純化和片篩試劑。該技術采用順磁性的磁珠、選擇性的結合特定大小的核酸,被眾多主流建庫試劑盒及測序專家選用。

        那么,金標準"還有優化的空間嗎?讓原廠來給您專業的分析:單從洗脫,有哪些優化的重點。

         

        用什么洗?


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        如上圖所示Tris or TE buffer (+/-EDTA)中,洗脫得率相比于純水有了顯著提升。而PBS溶液(pH 6-8)的效果緊隨其后,且PH無顯著影響。這可能與PBS中的鹽離子的存在有關。另一方面,從穩定性(CV)上看,Tris\TE\PBS洗脫都優于水。

         

        加多少?


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        如上圖所示:對比了不同加樣體積及洗脫體積的影響。所有的DNA起始濃度一致,因此洗脫體積越小,產物相對濃度越高(A);但是由于磁珠也會占用一部分洗脫溶液的體積(約1 µL),產物濃度越高則這部分損失越多(B);雖然小體積洗脫會得到影響核酸的得率,但是這并不是因為洗脫效率引起的:當投入量一致時,不同洗脫體積的得率無顯著差異(C)。

         

        洗多久?加熱嗎?

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        如上圖所示:在1分鐘的時候,洗脫已經進入平臺期(非指數期)提示大多數核酸已經洗脫下來。不加熱的情況下,1分鐘與20分鐘洗脫相比,1分鐘的量顯著偏低(p < 0.01)。從2分鐘洗脫開始,無顯著差異。加熱至60度后,洗脫速度更快:1分鐘與其他時長無顯著差異。

         

        小結

         

        上述實驗通過使用lambda phage DNA (49 kb),對貝克曼庫爾特的SPRI技術磁珠進行測試,提示:

         

        • 長達49 kb的核酸片段2分鐘可以被充分洗脫。

        • 使用Tris溶液可以提升洗脫效率和穩定性。

        • 不同的起始及洗脫體積對洗脫效率影響不大。

        • 但是小體積的物理限制會導致更多核酸損失于死體積。

         


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